作者姓名：管沉冰
　　论文题目：从生长锥到胞体的长距离钙离子信号介导Slit－2引起的神经细胞迁移的翻转
　　简介：管沉冰，男，1980年6月出生，2002年9月师从于中科院上海生命科学研究院神经科学研究所袁小兵研究员和蒲慕明高级研究员，于2007年7月获博士学位。

　　中文摘要
　　神经系统的发育，从神经干细胞的增殖、分化开始，然后迁移到特定位置，最后形成正确的网络连接。在这个过程中，神经细胞迁移是神经系统发育过程中的一个重要步骤，灵长类动物的前脑中有109个神经元参与迁移，最长的迁移路径可达数厘米。这些神经元通过迁移到达特定位置，聚集成核团或是形成分层结构，为形成正确的回路做好准备。
　　根据发生迁移时所处的发育阶段，可以把中枢神经系统中的神经细胞迁移分为两类：胚胎期发生的迁移和生后进行的迁移。前者以室管膜区（ventricular zone， VZ）刚成熟的神经元的迁移为代表，这与大脑皮层、脊髓背角分层等有关，这些过程基本都在胚胎期即完成。而后者包括小脑颗粒细胞从外颗粒层迁往内颗粒层、前脑亚室管膜层（anterior subventricular zone, SVZa）神经元经头端迁移流（rostral migratory stream, RMS）迁往嗅球成为中间神经元等。这些迁移过程是在生后完成（如小脑颗粒细胞迁移）或是终生发生（如SVZa往嗅球的迁移）。根据迁移过程中神经元与胶质细胞的相互作用大致又可分为两类：一类是由胶质细胞导向的迁移(glia-guided neuronal migration)，另一类是不依附于胶质细胞的切向迁移(tangential migration)。
　　在中枢，神经细胞完成迁移要涉及三步：神经元命运的决定并开始迁移，这是迁移起始的问题；神经元沿特定的途径和正确的方向迁移，这是迁移导向的问题；神经元到达恰当位置停止迁移并开始参与该区域的构筑，这是迁移终止的问题。在这三个阶段，不论何种迁移形式，都涉及到许多分子机制。对于迁移的导向问题，在无胶质导向的迁移中，在迁移途径（如RMS）的外围有排斥迁移的信号分子（如Slit），而在迁移途径中有一些相关分子促进迁移（如PS－NCAM、Ephrin等），从而实现限制其迁移的空间位置的作用。在有胶质导向的迁移中，原先认为导向作用可能仅由胶质细胞完成，但实验表明仅有放射状胶质存在，不足以决定神经元的迁移方向，在同一胶质纤维上可以看到相向或相背或来回迁移的神经元，这表明胶质细胞导向的放射状迁移中也应该有导向分子在起作用。
　　相对于研究神经细胞迁移的导向问题，轴突生长锥的导向更早吸引了研究者的兴趣。一个世纪前，著名的神经生物学家Ramon y Cajal就曾通过观察染色的神经组织作出描述：神经轴突顶端的生长锥应该能表现出一种运动的活性，并且应该和外周的白细胞趋化一样受到靶组织的吸引或是排斥。近20年来关于轴突导向的分子研究完全证实了Ramon y Cajal的描述，大量的吸引和排斥的分子和它们的受体被发现，许多内在的机制也一点点被揭示。这些导向因子包括最经典的导向因子（Netrins, Slits, Semaphorins, Ephrins），神经营养因子（BDNF, NGF），胚胎发育中的成形素（morphogen， 包括Wnt, BMP, Shh）等许多分泌形蛋白和固定在膜上的蛋白。
　　有趣的是，这些导向因子几乎也都参与神经细胞迁移的导向作用。而对脑片上和培养的神经细胞迁移的观察发现，迁移中的神经细胞的前方总有一个前导突起（leading process），前导突起的顶端总有一个类似于轴突生长锥的活跃结构，习惯上也称之为生长锥。在迁移运动中，前端生长锥的运动和神经元胞体的运动有很好的协调。还有观察发现，Netrin-1对迁移细胞的吸引作用可能是通过对突起的吸引来实现的。这一切都提示了神经细胞迁移的导向和生长锥的导向可能有内在的机制联系。一个有趣的假设就是：神经细胞的迁移中，导向分子的作用是通过前端生长锥的感受，然后通过一个长距离的从生长锥到细胞胞体的信号协调整个神经元的运动。当然，也可能胞体独立感受导向因子作用，而与生长锥无关。为了研究这个问题，我们用打散培养的小脑颗粒细胞为模型，观察体外迁移的单个颗粒细胞的生长锥运动和胞体运动，以及它们对外界排斥因子Slit的反应。
　　在神经细胞迁移和轴突导向的研究中，发现钙离子是一个很重要的信号分子。钙离子的不对称分布对吸引和排斥的轴突导向、神经细胞迁移有关键作用。而钙离子的自发振荡也与生长锥的延伸和神经元迁移的速度有着密切的关系。本论文研究了钙离子信号在传导从生长锥到细胞胞体的长距离信号及神经元迁移导向中的作用。
　　论文描述的实验中使用已知对神经细胞迁移有排斥作用的分子Slit-2来诱导迁移的翻转。Slit最早于1984年由Nüsslein-Volhard与Wieschaus在对果蝇的突变研究中发现，当时仅发现Slit主要在胚胎中线表达。而对Slit功能展开的研究起于1998年，先是发现其受体Robo（roundabout）突变型果蝇的中线处交叉神经元的导向发生缺陷。1999年的一系列遗传和生化的研究又发现，分泌性因子Slit正是Robo的配体，Slit－Robo信号起到了排斥一些轴突，使之无法穿过中线的作用。近来的研究还表明，robo的表达调控对穿过中线的轴突的不再返回有非常重要的作用。
　　不仅在轴突导向上起到排斥的作用，Slit还对SVZa迁往嗅球的神经元的迁移有排斥作用。体外共培养在胶质细胞上的小脑颗粒细胞的迁移也能受到Slit的排斥。之后发现在外周循环系统中，Slit对具有趋化性的白细胞的迁移也有排斥作用。
　　通过原位杂交分析发现，在P0的大鼠小脑中，Purkinje细胞有Slit-2表达，而在外颗粒层的颗粒细胞表达其受体Robo2。猜测这时候Slit-2的排斥作用可能是防止颗粒细胞过早地发生向内颗粒层进行迁移。
　　在实验中，通过显微镜实时观察的方法，观察了在排斥因子Slit的浓度梯度下，培养的小脑颗粒细胞的迁移行为，仔细分析了前端生长锥和胞体的运动协调。通过钙离子成像的技术，研究了在Slit作用下细胞内的钙信号的变化。还通过转染外源性DNA、生化测活和活细胞FRET技术，检测了调节细胞骨架的中心环节——Rho家族鸟苷三磷酸酶在Slit引发的迁移变化中的参与。
　　通过研究发现前端生长锥承担了感受Slit-2的主要功能，然后这一信号通过从生长锥到胞体的长距离细胞内钙离子波信号传递到胞体，并引发了整个神经细胞迁移的翻转。此外，还发现迁移的颗粒神经元的前方聚集了丰富的RhoA蛋白，在钙波信号引发的迁移翻转时RhoA的活性是必须的，而且活性的RhoA在迁移翻转过程发生了重新分布。因此，RhoA的重新分布可能是Slit-2引发的钙波信号的下游，并进一步负责调控细胞骨架成分的动态变化。
　　通过施加微浓度梯度和活细胞实时荧光标记观察等手段，对单个神经细胞受导向进行迁移的分子机制进行研究，排除了许多细胞间的干扰因素，使得研究细胞内机制更为方便。目前，研究神经细胞的迁移仍然是国际上非常活跃的研究领域，还有许多未解之谜有待揭开。而这些研究对于探索神经系统复杂的发育规律和提供损伤修复的手段都有极大的意义。

　　关键词：神经细胞迁移，Slit-2蛋白，钙波，Rho家族鸟苷三磷酸酶RhoA