作者姓名：宋献军
　　论文题目：控制水稻粒宽/粒重主效QTL的定位、克隆和功能研究
　　作者简介：宋献军，男，1974年3月出生，2002年9月师从于中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所林鸿宣研究员，于2007年7月获博士学位。

　　中文摘要
　　水稻是最重要的粮食作物之一，其养活了世界上近四分之一的人口。开展水稻遗传与育种研究一直成为许多国家近年来的重点。随着近年来世界人口的持续增长和环境的不断恶化，粮食产量增加却远远不能满足人类的需要。而作物产量形成遗传机制研究可以促进高产分子育种研究。但截至目前，人们对作物产量的分子调控机制仍然知之甚少。
　　水稻产量的提高主要决定于三方面重要的因素：分蘖数、穗粒数和粒重。控制分蘖数的基因Moc1的成功克隆和基因功能研究（Li等, 2003）揭开了人类研究粮食产量分子调控机制新的一页。近年来还克隆到控制水稻穗粒数的QTL/基因Gn1a (Ashikari等, 2005)，并对其功能进行了研究，使人们对作物产量的形成机制有了进一步的认识。与前两个性状相比，人们对控制水稻粒型和粒重的分子机制研究进展较慢。尽管许多年来人们对有关此类性状QTL或基因的定位研究有很多(Tan等，. 2000；Kubo等，2001；Xing等，2002；Thomson等，2003；Aluko等，2004；Li等，2004a)，但它们的分子调控机理还未知。Fan等(2006)对控制水稻谷粒长度/粒重QTL GS3进行了定位和克隆，该基因定位于第3染色体的着丝粒附近，其编码一种具有PEBP结构域的细胞膜蛋白，但其详细的功能研究未见报道。至今对控制水稻粒型/粒重的相关QTL/基因的分子调控机制研究尚未见报道。
　　粒型（谷粒的长度、宽度及长宽比）是受多个数量性状基因（QTL）控制的复杂性状，对水稻产量和品质都有影响。为了进一步探索控制作物粒型/粒重的分子遗传调控机理，我们选择在粒重上有显著差异的水稻品种“丰矮占 1 号”（小粒籼稻品种）和“WY3”（大粒粳稻品种）为亲本材料，并以“丰矮占 1 号”作为轮回亲本进行多次回交，构建了作图群体；以谷粒的长度和宽度为研究性状，进行了初步定位、精细定位以及高精确度连锁分析研究。最终我们克隆了控制水稻谷粒宽度和粒重的主效QTL GW2，并开展了相关功能研究，得到了以下主要研究结果： 
　　1、初步定位了控制水稻谷粒宽度和长度的两个主效 QTLs（GW2 和 GL3），二者分别位于第 2 和第 3 染色体上。 
　　2、通过精细定位和高精确度连锁分析，我们将控制水稻粒宽的 QTL GW2定位在 8.2kb 的物理区间内，其中只有一个候选基因，编码一个功能未报道的RING类型蛋白。大粒基因位点与小粒基因位点在编码区存在三个碱基变异，其中二个变异不引起氨基酸变化，而另外一个碱基在大粒基因中发生缺失，引入一个提前终止密码子使蛋白翻译提前终止，大粒GW2蛋白减少310个氨基酸，该结果得到了体外表达蛋白实验的验证。表明大粒表型是由于GW2的功能缺少而产生的。 
　　3、GW2 的转基因水稻分析结果显示，当转反义表达载体的转基因植株降低GW2 的表达量时会引起水稻粒宽和粒重增加；当转正义表达载体的转基因植株增加 GW2 的表达量时会引起水稻粒宽变窄和粒重减少，表明GW2是水稻粒宽和粒重的负调控因子，同时证明成功克隆了控制水稻粒型的主效 QTL GW2。 
　　4、 RT-PCR 分析和 GW2 promoter-GFP 的转基因水稻的 GFP活性观察结果显示，该基因无时空和组织表达特异性；利用洋葱表皮细胞进行的GFP-GW2 融合蛋白亚细胞定位结果显示，GW2 在细胞质中表达。 
　　5、利用大肠杆菌表达的 GW2 活性蛋白进行的生化分析表明，GW2 蛋白在体外能够发生蛋白泛素化反应，同时结合GW2基因的测序结果，我们证明了GW2蛋白属于一类新型的 RING E3 泛素连接酶，表明GW2参与蛋白泛素降解途径。
　　6.细胞学观测结果表明大粒基因位点比小粒基因位点增加水稻颖壳的细胞数目，从而促进颖壳增大，而细胞大小基本没有变化。表明GW2参与水稻颖壳的细胞分裂。 
　　6、用分子标记选择方法选育得到了控制水稻谷粒宽度的近等基因系 NIL (GW2)（以丰矮占 1 号为背景），携带大粒亲本 WY3 的 GW2 位点的目标片段长度仅为 1.4cM；相对丰矮占 1号，NIL (GW2)的谷粒宽度和粒重（增幅达49.8％）明显增加，从而引起单株产量显著增加，表明 GW2 在作物高产分子育种中具有应用前景。 
　　7、在已有实验结果的基础上，我们对 GW2 基因控制水稻谷粒宽度和粒重的可能调控机制进行了推测： GW2 蛋白作为一种新型的 RING E3 泛素连接酶参与泛素介导的蛋白降解途径，负调控水稻颖壳的细胞分裂；宽粒等位基因（WY3的 GW2 位点）由于发生提前终止突变失去相应的调控功能，其颖壳细胞分裂速度加快，导致颖壳变宽；宽的颖壳有利于胚乳的灌浆，最终导致谷粒变大。

　　关键词：水稻；粒重；QTL；分子标记；图位克隆；E3泛素连接酶；分子育种